Pharmingto słowo powstałe przez fuzję dwóch angielskich słów farming – farmerstwo i pharmaceutics – farmaceutyki. Zatem pharming to uprawa genetycznie modyfikowanych roślin w celach produkcji farmaceutycznie aktywnych substancji. Masowa skala uprawy pozwala produkować wielkie ilości niskim kosztem (w porównaniu do syntezy czy hodowli w bioreaktorach). Przeciwnicy upraw GM jako główny argument przeciw uprawą GMO używają możliwości rozprzestrzeniania się pyłku i „ucieczki” transgenicznych organizmów. To w przypadku roślin produkujących substancje aktywne leczniczo może być problemem.
Dlatego badacze z Instytutu Maxa Placka prowadzą od dawna pracę nad roślinami transplastomicznymi. Rośliny transplastomiczne to rośliny posiadające zmienione lub dodatkowe geny w ich genomie chloroplastowym. Materiał genetyczny znajduje się nie tylko w jądrze komórkowym, ale także w mitocondiach i u roślin w chloroplastach. Te małe genomy organelli to pozostałość po bakteryjnym pochodzeniu tych półautonomicznych struktur komórkowych. Tradycyjne organizmy transgeniczne noszą zmiany w genomie jądrowym i w konsekwencji tego zarówno komórka jajowa jak i pyłek są nosicielami dodatkowych genów. W przypadku roślin transplastomicznych pyłek nie jest nosicielem modyfikowanych genów, gdyż ziarenka pyłku nie zawierają chloroplastów. Wyklucza to rozprzestrzenianie się „genów” niesionych wiatrem lub rozniesionych przez owady.
Grupa prof. Bocka z Instytutu Maxa Plancka podjęła się próby transformacji genomu chloroplastowego i ekspresji w chloroplastach dwóch białek bakteriofagowych. Bakteriofagi to wirusy infekujące bakterie i jak każdy wirus potrafią skutecznie szkodzić swoim gospodarzom. Tu na scenę wchodzą: białko Pal - amidaza tnąca linkery w strukturze peptydoglikanu; natomiast białko Cpl-1 to lizozym trawiący sacharydy ściany komórkowej bakterii. Geny kodujące te białka pochodzą z bakteriofaga żerującego na Streptococcus pneumoniae, bakteriiwywołującej m.in. zapalenie płuc.
W technikach inżynierii genetycznej bardzo często wykorzystuje się bakterie Eschericha coli w roli małych fabryk naprawiających i kopiujących pożądane geny. Problemem w pracach okazało się, że chloroplastowe promotory (informacje skąd i kiedy zacząć „czytanie” genu) „przeciekają” prowadząc do ekspresji fagowych białek i śmierci bakterii E. coli . Nie dało się kontynuować pracy klasyczną metodą konstrukcji genów do transformacji. Aby ominąć ten problem trzeba było zablokować „przeciekanie” czyli niekontrolowaną ekspresję klonowanych genów. Wykorzystano różnicę w kontroli ekspresji genów między bakteriami i chloroplastami. Między promotor a gen kodujący białko fagowe wstawiono dwa terminatory transkrypcji, czyli sekwencje „informujące” aparat transkrypcyjny bakterii, że tu jest koniec genu. Chloroplasty nie używają takich terminatorów, więc dla nich nie są przeszkodą. Dodatkowo konstrukt genowy wyposażono w sekwencje loxP , dzięki czemu marker selekcyjny i terminatory mogą być później wycięte z genomu rośliny. W efekcie uzyskano plazmid, który można bezpiecznie namnażać w E. coli, mimo, iż nosi toksyczne dla nich geny.
Tak przygotowane geny wprowadzono do genomu tytoniu za pomocą bombardowania kawałków liści mikroskopijnymi kuleczkami ze złota (śred. 0,6 µm) z przyczepionymi do nich DNA. Fragmenty liści traktowano potem hormonami stymulującymi regenerację i antybiotykiem eliminującym komórki bez transgenu niosącego odporność nań. Roślinki, które wyrosły skrzyżowano z tytoniem noszącym białko Cre („molekularne nożyczki”), które wycięło fragmenty oflankowane sekwencjami loxP. Tak powstały rośliny tytoniu, które posiadały w genomie chloroplastów geny kodujące białka toksyczne dla bakterii. Wydajność produkcji fagowych białek była bardzo dobra: od ≈0.5 g (Cpl-1) do 2 g (Pal) białka na kilogram świeżej masy roślin tytoniu.
Ponieważ fagowe białka stanowia 10-30 % rozpuszczalnych białek, taki ekstrakt dodano do kultury S. pneumoniae. Ekstrakt z białkiem Pal w ciągu 30 minut zabijał prawie 80% bakterii, a po kolejnych 30 min. żywych pozostawało zaledwie 7% bakterii. Te białka są skuteczne także przeciw S. pneumoniae odpornym na antybiotyki.
Osiągnięcie zespołu R. Bocka to kolejny krok w stronę „pharmerstwa” - uprawy ważnych dla nas białek w roślinach transgenicznych.
---
Melanie Oey, Marc Lohse, Lars B. Scharff, Bernd Kreikemeyer, and Ralph Bock Plastid production of protein antibiotics against pneumonia via a new strategy for high-level expression of antimicrobial proteins PNAS 2009 106:6579-6584; published online before print March 30, 2009,
Dostęp do artykułu jest otwarty
33925
