W poprzedniej części tego minicyklu opisałem w jaki sposób można wprowadzić modyfikację do genomu rośliny. Ale sama modyfikacja to dopiero początek całego procesu. Jedną z przyczyn takiej sytuacji jest to, że modyfikacja ma małą wydajność (tylko ułamek ułamka procenta z komórek poddanych procedurze będzie zmodyfikowanych) co dodaje konieczność selekcji. Kolejną jest to, że modyfikacja w wypadku roślin jest wprowadzona w losowe miejsce w genomie. Co powoduje kolejną rundę selekcji.
Selekcjoner
W naszym przykładzie wykorzystałem roślinę z genem kodującym GFP – białko, które w odpowiednim świetle świeci na jasnozielono. W takim przypadku selekcja jest prosta, wręcz banalna – wystarczy na szalkę z kulturą tkankową poświecić światłem o odpowiedniej długości fali i voila. W wypadku roślin komercyjnych proces selekcji jest nieco trudniejszy. Rośliny odporne na Roundup można wyselekcjonować hodując je na pożywce zawierającej ten herbicyd w różnych stężeniach i wybrać kilkaset linii, które wykazują najlepszą tolerancję. W wypadku roślin odpornych na owady sprawa jest jeszcze trudniejsza – ale można wykorzystać do selekcji owady. Puszczać nieszczęsne stworzenia na kolejne szalki Petriego i czekać na to, aż któreś z nich padną. Komórki z takich szalek przechodzą do kolejnej rundy selekcji, muszą być ponownie sprawdzane aż do uzyskania czystej linii. Takie metody selekcji są bardziej lub mniej skuteczne. Trudno wyobrazic sobie przykładowo taką bezpośrednią metodę w wypadku np. pomidora o wyższej zawartości cukru, albo jabłka o dłuższym czasie przechowywania. Dlatego są metody selekcjonowania oparte na wykrywaniu obecności wprowadzonego genu albo białka, które taki gen koduje. Wykrywanie samego genu jest znacznie bardziej pracochłonne ale dzięki zastosowaniu tej strategii możemy za jednym zamachem zlokalizować, gdzie zaszła modyfikacja – co pozwala nam od razu wytypować modyfikacje rokujące nadzieje.
Rys. 1. Nad strzałką losowy fragment genomu rośliny z żóltym genem. W wyniku modyfikacji nasz pomarańczowy gen może wbudować się: góra: w środku innego genu; środek: w najbliższym sąsiedztwie innego genu bądź w środku sekwencji regulującej pracę jakiegoś genu; dół: z dala od kodujących sekwencji, najchętniej w jakimś miejscu słabo zakonserwowanym ewolucyjnie (im coś słabiej zakonserwowane, tym w większości przypadków mniej potrzebne). Nas najbardziej interesuje scenariusz 3 – dzięki temu jedyną znaczącą zmianą w porównaniu do wyjściowego organizmu jest nasza modyfikacja a nie nasza modyfikacja plus zaburzenie działania innych genów.
Poszukiwacze zaginionych genów
W poprzedniej notce wspominałem o technice PCR używanej do namnożenia znanej nam sekwencji. Istnieją dziesiątki modyfikacji tej techniki i jedna z nich pozwala nam namnożyć nieznaną sekwencję w sąsiedztwie znanej nam sekwencji. Ponieważ znamy sekwencję wprowadzonego przez nas genu, dzięki temu możemy namnożyć sekwencje sąsiedzkie i je zbadać. To w połączeniu ze znajomością genomu modyfikowanej rośliny pozwala nam z całą pewnością stwierdzić gdzie nastąpiła modyfikacja i dowiedzieć się, z którym z trzech scenariuszy z rys. 1 mamy do czynienia.
Istnieje oczywiście dziesiątki innych metod wykrywania modyfikacji i ich lokalizacji ale w moim minicyklu nie chodzi o stworzenie szczegółowego i całkowicie niestrawnego dla laików podręcznika a o przybliżenie technik związanych z GMO w zaledwie lekko niestrawny sposób. Po udanej selekcji i zlokalizowaniu naszych modyfikacji można przystąpic do analizy roślin. Ponieważ cały czas występuje ryzyko nieprzewidzianych przez nas zmian, trzeba sprawdzić nasze warianty. Istnieje kilka metod i rutynowo wykorzystuje się kombinację kilku z nich. Pierwszą metodą – prostą ale pozwalającą wyłapać anomalie – jest analiza chemiczna takiej rośliny. Bilans pierwiastków, zawartość białka, cukrów i tłuszczy. Prosta chemia ale jeżeli różnice między wyjściową a zmodyfikowaną rośliną są duże – łatwo je w ten sposób odrzucić. Później jest kilka możliwych technik pozwalających na masową identyfikację białek albo RNA w takiej roślinie a nawet w poszczególnych tkankach.
W pierwszej części przedstawiłem diagram z „centralnym dogmatem” biologii. Zgodnie z nim, białka powstają na podstawie informacji zakodowanej w DNA a pośrednikiem w tym procesie jest RNA. Ponieważ organizmy cały czas produkują białka, cały czas jest w nich obecna spora pula RNA. Można je wyizolować z komórek dwóch roślin – jednej GMO i jej niezmodyfikowanego odpowiednika. Zbadanie tego RNA, ich sekwencji, pozwala nam ilościowo i jakościowo oszacować produkcję białek w obu roślinach i dzięki temu zobaczyć, gdzie leżą główne różnice między obydwoma odmianami. Jeżeli są zbyt duże – kontynuacji pracy z taką odmianą nie ma sensu. Docelowo, chcemy roślinę, która różni się tylko tym, że produkuje białko w oparcu o wstwiony przez nas gen, podczas gdy wszystkie inne białka są produkowane na poziomie w zakresie spotykanym w niemodyfikowanych odmianach. Nie jest to idealnie możliwe ale można być bardzo blisko ideału. Oczywiście mozna zrobić takie same porównanie analizując rośliny na poziomie białek.
Dopiero po takich procedurach selekcyjno – weryfikacyjnych, kilka odmian może przejść do dalszych rund – testów na zwierzętach, próbach polowych, testach wydajności. O czym w szczegółach napiszę w kolejnej części cyklu.
