Czytanie DNA, czyli jak się sekwencjonuje

Mam już dość pisania o polityce. Za bardzo mnie to rozprasza i stresuje. Wracam do nauki i laboratorium. Dzisiejsza notka dotyczy bardzo ciekawej metody badawczej. Jest to sekwencjonowanie, czyli odczytywanie sekwencji fragmentów DNA, na podłożu stałym. Jest to metoda nowatorska, twórcze wykorzystanie "starych i dobrze znanych" reakcji. Zaletą tej metody jest to, że w jednej rundzie analizy w 8 równoległych rowkach, można przeprowadzić setki tysięcy procesów sekwencjonowania o łącznej "masie" miliarda zasad nukleotydowych. W procesie tym wykorzystuje się dwie reakcje PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy DNA). Opisze proces krok po kroku, odpowiednio do zamieszczonych obok ilustracji.

1. Przygotowanie próbki do analizy wymaga przyłączenia na obu końcach badanych fragmentów DNA krótkich adaptorów. 2. Jednoniciowe DNA łączy sie z podłożem płytki do analizy poprzez interakcje podłoża z adaptorami. Powierzchnia płytki pokryta jest gęstą "murawą" krótkich fragmentów DNA, które pełnią rolę starterów reakcji.

3. Dodaje sie enzym (Polimerazy DNA) i niemodyfikowane nukleotydy (G,A,C,T) - rusza reakcja PCR, namnażanie DNA. Fragmenty DNA tworzą mostki, a ich "zaczepy"do podłoża pełnia rolę starterów do PCR. 4. W tej reakcji powstaje komplementarny fragment DNA ("lustrzane odbicie").

5. Matryca i komplementarna nic rozdzielają się, ale dzięki zaczepieniu w podłożu znajdują się obok siebie. Teraz oba fragmenty mogą zostać wykorzystane jako matryca (jak w p 3.). 6. Po wielu cyklach kroków 3) 4) i 5) na płytce do sekwencjonowania powstają kolonie złożone z własnych kopii.

7. Zaczyna się sekwencjonowanie - pierwszy krok chemiczny. Do środowiska reakcji dodawane są modyfikowane nukleotydy (G,A,C,T) świecące po pobudzeniu światłem lasera. 8. W tej reakcji wbudowanie danego nukleotydu wiąże się z impulsem światła o konkretnym kolorze. Dane zbierane są przez wysokoczułą kamerą.

9. Drugi krok chemiczny. Ponownie dodaje sie enzym i świecące pochodne nukleotydów. Wbudowaniu kolejnego nukleotydu przez polimerazę towarzyszy kolejny impuls po pobudzeniu laserem. 10. Impulsy wysyłane przez grupy kopii fragmentów DNA są rejestrowane.

11. Oba powyższe kroki powtarzane są wiele razy. Seria obrazów zarejestrowanych przez kamerę pozwala odczytać sekwencje fragmentu DNA. Kolejność błysków różnobarwnego światła odpowiada sekwencji matrycy. 12. Otrzymane wyniki są składane przez komputer i porównywane z innymi sekwencjami np. wzorcami.

Genialne. Proste, prawda?

Podsumowanie:

Zalety: Szybkie przygotowanie próbki; szybkość reakcji - równoczesne sekwencjonowanie wielu fragmentów; możliwość wykorzystania fragmentów RNA - badania nad ekspresja czy miRNA; pojemność sekwencjonowania aż 1 mld zasad

Wady: długość sekwencjonowania około 40 zasad; trudna analiza surowych danych; wysoki koszt.

Źródło: www.solexa.com