Czytanie DNA, czyli jak się sekwencjonuje (2)

Tak jak zapowiedziałem w kilku miejscach w Salonie24 jeszcze jeden wpis o sekwencjonowaniu. Tekst znowu dla wtajemniczonych. Musze trzymać poziom ;) Chciałbym przedstawić inną nowatorską metodę. Ta metoda sekwencjonowania, tak jak sekwencjonowanie wg Solexy, pozwala prowadzić badania metagenomiczne (poznajcie kolejną –omikę, kilka słów o niej pod koniec).

Przygotowanie DNA do sekwencjonowania wymaga poszatkowania go na małe fragmenty długości 300-500 par zasad. Do obu końców dokleja się krótkie sekwencje adapterowe, które później posłużą jako startery do PCR i właściwego sekwencjonowania. Koniec jednego z adapterów związany jest z cząsteczką biotyny (witamina H). Biotyna i białko streptawidyna tworzą bardzo silne kompleksy. W ten sposób możliwe jest rozdzielenie dwóch populacji DNA: znakowanej i nieznakowanej biotyną. Do dalszego procesu wykorzystuje się tak przygotowane nieznakowane jednoniciowe DNA.

Pojedyncze nici DNA wiązane są z kuleczkami o średnicy około 28 μm. W standardowych warunkach reakcji wykorzystuje się 1,5 mln kuleczek. Mieszaninę reakcyjną do PCR miesza się następnie z olejem tworząc emulsję, czyli drobne kropelki zawieszone w oleju. Warunki są tak dobrane, by kropelki zamykały się wokół kuleczek z doczepionym do nich DNA. Tak powstają pikoreaktory, gdyż objętość takiej kropelki z kuleczką jest rzędu kilkudziesięciu pikolitrów (1 pikolitr = jedna bilionowa część litra, 10^-12 l.), w których zachodzi reakcja PCR. W tej reakcji pojedyncza nić DNA związana wcześniej z kuleczką da około 10 mln kopii fragmentu DNA.

Kuleczki wraz z otaczającymi je milionami kopii fragmentów DNA pakowane są do „piko-studzieniek”. Na specjalnie przygotowanej płytce o wymiarach 40x75 mm znajduje się 860.000 studzienek, każda o objętości około 75 pl (obraz mikroskopowy poniżej). Do jednej studzienki pasuje więc tylko jedna kuleczka z produktami reakcji PCR. Kuleczki w studzienkach zalewane są mieszaniną enzymatyczną. W mieszaninie znajdują się dwa enzymy: ATP-sulfurylaza i lucyferaza, dzięki którym lucyferyna może zacząć świecić (chemiluminescencja). Metoda wykorzystująca świecenie lucyferyny nazywa się pirosekwencjonowaniem. Miejsce i siła rozbłysków zapisywane jest przez czułą kamerę.

Płytka z kuleczkami przemywana jest po kolei roztworami zawierającymi wyłącznie jeden z czterech nukleotydów (dTTP, dGTP, dATP, dCTP). Czyli, gdy w etapie przemywania nukleotydem tymidynowym (dTTP) dojdzie do rozbłysku, jest to znak, że ten nukleotyd został wykorzystany – odczytano kolejną literę sekwencjonowanego DNA. Cztery (są cztery nukleotydy) przemywania płytki z kuleczkami powtarza się 42 razy. W efekcie otrzymuje się koło 300 tysięcy sekwencji o średniej długości 106 nukleotydów. To już dość by zidentyfikować fragment DNA, gen.

Nowatorskim pomysłem jest wykorzystanie oleju do wytworzenia emulsji, tak by każda kropelka była maleńkim reaktorem PCR. Stąd ta metoda określana jest jako emPCR.

Metagenomika wspomniana na początku to analiza genów z próbek pobranych bezpośrednio ze środowiska. Przykładem może być odczytywanie genów organizmów w planktonie czy mule dennym jeziora. W każdym mililitrze takiej próbki można znaleźć tysiące gatunków mikroorganizmów. Takie masowe sekwencjonowanie metagenomu („mieszaniny” genomów różnych gatunków) pozwala np. dowiedzieć się jaki są w niej organizmy. To wszystko bez mozolnej pracy selekcjonowania gatunków i izolowania ich DNA.

Tą metodą zsekwencjonowano genom Jamesa Watson. Napisał o tym woyzeck.

źródła:

www.454.com

Margulies, M. Eghold, M. et al. Nature. 2005 Sep 15; 437(7057):326-7