Chromatografia cz.1

W opisie mojej osoby napisałem, że jestem zainteresowany wysokosprawną chromatografią cieczową. Najwyższy czas napisać czym jest chromatografia cieczowa i dlaczego jest to moje „ekstremalne zainteresowanie”. Planuję rozłożyć ten temat na kilka wpisów na blogu. Jak w każdej dobrej opowieści trzeba mieć wstęp.

Dawno, dawno temu, za rzekami i lasami w stolicy Priwislanskiego Kraju był sobie uniwersytet. Pracował tam wybitny rosyjski botanik Michail Semionowicz Cwiet. Jako pierwszy na świecie w 1901 zastosował metodę, którą później nazwał chromatografią (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) [1]. Cwiet użył kolumny (rurki) wypełnionej węglanem wapnia, by rozdzielić chlorofil i karotenoidy wyizolowane z liści. Natomiast w 1952 nagroda Nobla z dziedziny chemii została przyznana A. Martinowi i R. Synge za odkrycie chromatografii rozdzielczej.  

Chromatografia to metoda, w której mieszaninę rozdziela się wykorzystując różnice w oddziaływaniu rozdzielanych substancji ze złożem (faza stacjonarna). Faza ruchoma (eluent) przepływając przez fazę stałą „wypłukuje” rozdzielane substancje, które różnią się siłą oddziaływania z fazą stacjonarną. Substancjom silniej wiążącym się ze złożem przepłynięcie przez złoże zajmie dłużej niż substancjom słabo wiążącym się. Chromatografię można wykorzystać do analityki lub do preparacji, czyli otrzymywania substancji w formie oczyszczonej. Jak rozumieć to, co napisałem? Proszę wyobrazić sobie mieszaninę opiłków aluminiowych i żelaznych („faza ruchoma”) oraz magnes („faza stała”). Oba składniki mieszaniny inaczej oddziałują z magnesem, więc by oddzielić je od siebie, można przesunąć magnesem nad mieszaniną i „wyłowić” opiłki żelazne. To oczywiście uproszczenie, ale mam nadzieję, że dobrze ilustruje problem.

Chromatografia jako metoda istnieje juz ponad 100 lat i doczekała się wielu modyfikacji. Można podzielić metody chromatograficzne według stanu skupienia fazy ruchomej:

• chromatografia cieczowa – wykorzystuje ciecz jako fazę ruchomą, zarówno roztwory wodne jak i rozpuszczalniki organiczne;
• chromatografia gazowa – wykorzystuje gaz (najczęściej hel) jako fazę ruchomą;
• chromatografia nadkrytyczna – wykorzystuje ciekłe gazy (najczęściej dwutlenek węgla).

 Można dokonać podziału według cech fazy stacjonarnej:

• chromatografia bibułowa – anality są rozdzielane na specjalnej bibule chromatograficznej;
• chromatografia cienkowarstwowa – bardzo podobna do bibułowej, lecz tutaj faza stała jest naniesiona cienką warstwą na sztywną płytkę;
• chromatografia jonowymienna – rozdział następuje wg siły oddziaływań jonowych miedzy analitami a złożem, czyli im silniejszy ładunek tym mocniejsze wiązanie z fazą stacjonarną.
• chromatografia powinowactwa – opiera się na bardzo wybiórczych interakcjach miedzy analitem a złożem, np. oddziaływania antygen-przeciwciało. Stosowana do izolacji np. enzymów;
• chromatografia odwróconych faz – w której eluent jest dużo bardziej polarny niż złoże (np. krzemionka pokryta grupami oktadodecylowymi);
• sączenie molekularne – gdzie złoże działa na zasadzie „odwróconego” sita, małe cząsteczki wnikają w pory złoża, podczas gdy duże, nie mogąc się tam dostać, są wymywane ze złoża wcześniej.

            To tylko rąbek teorii chromatografii. Napisano juz niejedna książkę na ten temat. I na pewno jeszcze nowe metody i zastosowania zostaną opracowane.

Gdyż chromatografię można robić przy wykorzystaniu prawie wszystkiego. Doświadczenia chromatograficzne można też zrobić w domu. Aby przeprowadzić chromatografię bibułową, przydałaby się bibuła sorpcyjna. Ale jeśli akurat nie macie tego w domu, od biedy kartka brystolu jako faza stacjonarna też się nada. Byle to nie był papier kredowy. Potrzebny będzie jeszcze słoiczek, eluenty i substancje do rozdziału. Jako eluentów proponuję użyć denaturatu, zmywacza do paznokci, rozpuszczalników do farb, itp.

1. Wykrój z papieru pasek szerokości kilku centymetrów, tak by się zmieścił w słoiczku, oraz na tyle długi, by sięgał górnej krawędzi naczynia.
2. Nalej eluentu do słoiczka, zamknij naczynie i poczekaj 5 min. aż wypełni się oparami. Nie potrzeba wiele, wystarczy kilka milimetrów wysokości na dnie. Co do składu eluentu zostawiam pole do eksperymentowania, gdyż różne substancje różnie będą się zachowywać przy użyciu różnych eluentów i ich mieszanin.
3. Na wysokości 1 cm od dolnej krawędzi paska papieru zaznacz linię i na linii narysuj flamastrem kropkę. Kropka o średnicy 2-3 mm wystarczy. Obok, w odległości 5-10mm, dodaj kolejną kropkę zrobioną np. flamastrem innego koloru lub innej produkcji, itd.
4. Teraz delikatnie wstaw pasek papieru do słoiczka, tak by koniec zamoczony był w eleuncie, ale kropki nie dotykały poziomu cieczy. Zamknij słoiczek i czekaj.
5. Gdy front eluentu nasączającego papier dotrze do szczytu, wyciągnij go delikatnie i wysusz w dobrze wentylowanym miejscu. Podziwiaj wyniki :)  

Flamastry zawierają barwniki różniące się rozpuszczalnością. Tę cechę wykorzystuje się w tym doświadczeniu. Eluent nasączający papier będzie „zabierał” ze sobą z kropki zrobionej flamastrem barwniki wg malejącej rozpuszczalności, czyli na szczycie znajdzie się najlepiej rozpuszczalny barwnik. Doświadczenie jest łatwe do powtórzenia przy różnych warunkach, z różnymi eluentami i różnymi substancjami. Polecam zabawę z ekstraktami alkoholowymi z liści różnych roślin.

Sam przeprowadziłem takie doświadczenie dla was.

Zastosowałem,

• jako eluenty: wodę, etanol techniczny, acetonitryl, aceton i mieszaninę powyższych w stosunku 1:1:1:1;

jako analizowana próbkę:

• trzy czarne flamastry firmy edding (1,2,3), po jednym firm securlab (4) i staedtler (5);  
• cztery flamastry edding w kolorach czarnym (1), czerwonym (2), niebieskim (3) i zielonym (4); 

Wyniki:

 

 Widać doskonale, że czarne czarnemu nierówne. Cienkopis Staedtler (5) używa tuszu dobrze rozpuszczalnego w wodzie, ale dzięki rozpuszczalnikom organicznym ujawniły się inne kolory. Próbka 4. (Securlab) ujawniła obecność brązowego barwnika w tuszu. Ważną dla mnie informacją jest fakt, że marker Edding (1) jest prawie całkowicie zmywalny acetonem, podczas gdy inne markery tej firmy (2,3) zawierają barwniki gorzej rozpuszczalne w tym rozpuszczalniku.

Czerwony marker firmy Edding zawiera brązowy barwnik w tuszu. Ładnie rozdzieliły się barwniki tuszu zielonego. Barwniki rozdzielane w tym doświadczeniu mają podobną rozpuszczalność w acetonie i acetonitrylu. Wyjątkiem jest fioletowy barwnik znajdujący się w niebieskim tuszu. 

 Miłego eksperymentowania.