Spróbuję przybliżyć metodykę, leżącą u podstaw wykrywania modnego ostatnio wirusa. Zacznijmy od opisu infekcji. Powiedzmy, że z powietrza wciągnąłem do płuc jednego wirusa. Wchodzi do komórki, gdzieś w drogach oddechowych. Po jakimś czasie z tej komórki wychodzi wiele cząstek wirusów potomnych. Wchodzą do innych komórek, sytuacja się powtarza, na tym etapie mamy ciąg geometryczny namnażania wirusa. Gdy go przybywa zaczyna być rozpoznawany przez układ immunologiczny, odpowiednie limfocyty B namnażają się i wytwarzają przeciwciała, rozpoznające wirusa.
Wskutek działalności układu immunologicznego tempo namnażania wirusa maleje. Pojawia się też śluz powstający pewnie głównie z rozpadających się komórek, który zalegając w płucach utrudnia wymianę oddechową. Śluz dostaje się do gardła i podrażnia je powodując kaszel, rozsiewający wirusy. Jeśli obrona się powiedzie, wirusa będzie coraz mniej, aż w końcu się pozbędziemy ostatniej sztuki.
Testy mogą wykrywać trzy elementy:
- Kwas nukleinowy, tu RNA.
- Białka na powierzchni.
- Przeciwciała przeciwko wirusowi.
Ad.1. RNA wirusowy.
W chwilę po złapaniu wirusa, oczywiście, nie wykryjemy nic. W miarę namnażania wirusy pojawią się w wymazie z gardła, początkowo nieliczne, potem coraz więcej, a po przesileniu ich liczba zacznie spadać, w końcu do zera. Pobrany na waciku wymaz jest odsyłany do laboratorium, które się nim zajmie. Najpierw odczyszczany jest RNA, myślę, że stosowana jest uproszczona metodyka i potrwa to np. 30 minut. Potem "przetłumaczony" na DNA, metodyka dość standardowa, może zająć kilkanaście minut.
Uzyskany materiał jest substratem do reakcji real-time PCR. PCR to namnażanie specyficznego fragmentu DNA, używając standardowego zestawu odczynników oraz dwóch specyficznych: krótkie, ok. dwudziestonukleotytowe kawałki DNA o sekwencji odpowiadającej fragmentom genów wirusa, nazwijmy je starterami. Otrzymuje się je chemicznie w ciągu kilku godzin i kosztują grosze. W reakcji PCR probówka umieszczana jest w maszynie, w której w pewnych cyklach zmienia się temperatura, a w każdym cyklu następuje podwojenie ilości materiału, czyli jeśli wyjściowo jest np. 100 cząstek, to będzie ich 200, 400, 800... A po dwudziestu cyklach ok. 108, lub jak kto woli 100 milionów. To namnażanie sprawia, że metoda jest bardzo czuła.
To był zwykły PCR, w używanym tu "real-time" dodawany jest dodatkowy odczynnik, np. specjalny, zmodyfikowany starter, łączący się do środka namnażanego fragmentu, nazwijmy go sondą. To przyłączenie wiąże się z powstaniem określonej barwy, wykrywanej przez naszą maszynę. Czyli w pierwszym cyklu reakcji zabarwienie będzie jak kropla tuszu wlana do basenu, a po tych dwudziestu cyklach jak całe wiadro. Te reakcje są przeprowadzane w płytkach zawierających 96 takich probówek (tu nazwijmy studzienkami), kto ciekawy, niech wrzuci w google hasło "real time plate", to obejrzy sobie taką płytkę, ma wymiary ok. 10cm. Sondę też można zamówić w jednej z kilku polskich firm, kosztuje znacznie więcej niż zwykły starter, ale wyjdzie pewnie około 1zł na próbkę, choć mogę się mylić 10 razy. Myślę, że na zamówienie rządowe sonda powinna być gotowa w ciągu doby.
O tym nie piszą, ale taka reakcja jest "ilościowa z problemami". Tzn. maszyna po każdym cyklu odczytuje poziom barwnika, czyli mierzy ilość namnożonego DNA, dla wszystkich studzienek. Jeśli z mojego materiału ze szczytu choroby do studzienki trafiło 10 tysięcy cząstek wirusowego DNA, to po dziesięciu cyklach będzie go 10 milionów, przyjmijmy, że jest to ilość dobrze wykrywalna. Jeśli byłem na początku lub pod koniec choroby i byłoby to 10 cząstek, to podobny poziom barwnika zostanie wykryty po dwudziestu cyklach. Ale te 10 cząstek to może być za mało, żeby je wykryć, są różne artefakty zakłócające wynik. Dodatkowo dochodzą problemy ilościowego oznaczania: nie da się pobrać precyzyjnie porównywalnej ilość materiału. Dlatego nie dziwi, jeśli wyjdzie wynik ze znakiem zapytania lub negatywny. Jeśli choroba jest w fazie rozwoju to za 2 dni wirus może być już wykryty w dużych ilościach.
Metodyka tu używana jest prawdopodobnie w akredytowanych laboratoriach zrobotyzowana, czyli jeśli do każdej studzienki w płytce umieścimy pojedynczo próbkę materiału z innego pacjenta, robot będzie przekładał do drugiej płytki w której zajdzie kolejna reakcja, itd. Jak wspomniałem, odczynniki kosztują niedużo, za to droga jest maszyna i istotne, żeby miała zaufaną obsługę. Myślę, że jeden cykl maszyny trwa ok. 2 godzin.
Reasumując, RNA wirusa możemy wykryć od któregoś momentu od zakażenia aż prawie do końca choroby, jest to na pewno najczulsza z metod. Gdy jest już niewykrywalny, wypada chyba odczekać przed wypuszczeniem ozdrowieńca "na miasto", żeby pozbył się ostatnich resztek wirusa.
Gdzieś napotkałem i zapodziałem informację o wspaniałych testach molekularnych, które wykrywają wirusa w kilka minut i nie potrzebują maszyny do real-time PCR. Nie znalazłem konkretnych informacji, ale na zdjęciu była jakaś skrzyneczkowata maszyna. Z braku opisu mogę jedynie podejrzewać, że używają sondy, podobnej do opisanej powyżej, która wiążąc się z RNA, otrzymanym bezpośrednio z materiału pacjenta, powoduje powstanie barwnika, a skrzyneczkowate urządzenie będzie go odczytywało. Jeśli tak jest, to metoda będzie miała znacznie mniejszą czułość i będzie wykrywać wirusa przy jego dużo większym stężeniu.
Ad.2. Białka wirusa.
Opracowanie testów na wykrywanie białka jest nieporównywalnie trudniejsze niż na kwasy nukleinowe. Potrzebujemy przeciwciał, które np. można otrzymać z surowicy ozdrowieńców. Ale tu pula przeciwciał z jednego pacjenta będzie się różnić od innego. I trzeba je odizolować od całej reszty. Bo np. kiedyś miałem grypę, a teraz koronawirusa, to mam przeciwciała przeciw obu, a nie chcielibyśmy pomieszać diagnozy tych drobnoustrojów? Można przytwierdzić wirusa do dna, w płytkach podobnych do linkowanych powyżej, a następnie wprowadzić przeciwciała, które się do niego przyczepią. Te przeciwciała mogą mieć dołączony barwnik, zaobserwowalibyśmy więc "wybarwienie" dna studzienki proporcjonalne do ilości wirusa. Nie natknąłem się na informacje sugerujące wprowadzanie tego typu testów, więc tematu nie będę rozwijał. Należy jedynie dodać, że tu, podobnie jak przy wykrywaniu RNA, otrzymamy wynik pozytywny w czasie trwania infekcji, na pewno z dużo niższą czułością, więc raczej posłuży do wykrywania zaawansowanego stanu chorobowego.
Ad.3. Przeciwciała przeciwko wirusowi.
Jak pisałem na początku, przeciwciała zaczynają się pojawiać z pewnym opóźnieniem w stosunku do namnażania się wirusa. Ich ilość wzrasta i osiąga szczyt w okolicach końca infekcji. I tu jest zasadnicza różnica w stosunku do wykrywania cząstek wirusa: gdy pozbyliśmy się ostatniego zarazka przeciwciał jest wciąż bardzo dużo.
Powszechna metoda ich wykrywania, to test ELISA. Trzeba mieć wyizolowane cząstki wirusa, lub jego białka. Przyłączamy je do dna studzienki, firma produkująca testy przygotowuje już gotowe płytki. Do studzienek dodajemy surowicę pacjenta, jeśli są przeciwciała, to przyłączą się do denka, wylewamy pozostały płyn i traktujemy odczynnikiem rozpoznającym ludzkie przeciwciała. Ta reakcja jest skorelowana z pojawieniem się zabarwienia, które możemy zmierzyć, będzie proporcjonalne do ilości przeciwciał anty-Covid. Metoda ta będzie bardziej wyskalowana ilościowo niż wykrywanie wirusa w śluzie, bo ilość użytej surowicy może dokładnie dozować.
Cechą istotną wykrywania przeciwciał jest to, że będą obecne po przebyciu choroby, choć ich ilość będzie stopniowo spadać. We wszelkich dyskusjach o losowym przebadaniu całości lub części populacji ta metoda będzie miała przewagę nad opartymi o PCR, gdzie trzeba się wstrzelić w circa kilkunastodniowe okienko.
Moim celem było przybliżenie metodyki. Omijałem masę detali, licząc na większą przejrzystość. Pewne słowa podkolorowałem, może komuś to pomoże w poruszaniu się po tekście. Sam chętnie bym poznał więcej szczegółów na temat przeprowadzanych testów, bo informacje w mediach są szczątkowe, a przebijać się przez wszystkie wyniki w Google'ach mi się nie chce.
